ПЦР диагностика – что это такое? Какие заболевания определяет

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) диагностика: что это такое

В современном мире существует множество способов обнаружить возбудителей заболеваний на разных этапах развития заболевания. Одним из таких методов является PCR (метод ПЦР или полимеразная цепная реакция), позволяющий выявить инфекцию на самом раннем этапе. Буквально одна единица ДНК или РНК уже могут указать на наличие того или иного возбудителя в организме при должном уровне подготовки пациента и профессионализма лаборантов медицинского учреждения.

ПРЦ-исследование, что это такое?

Анализ на ПЦР заключается в копировании ДНК и РНК возбудителя в лабораторных условиях. Так как основным хранилищем генетической информации является ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), образованная 2 нитями, соединенными нуклеотидами, именно при множественном копировании (синтезе) этой кислоты можно установить наличие патогенного организма, если речь идет о бактерии.

Бактерии имеют свою собственную оболочку, защищающую их от внешней среды, которая нередко является агрессивной по отношению к последним. У вирусов же нет собственной оболочки (у некоторых представителей имеется нечто похожее на оболочку), а информацию в себе несет не ДНК, а РНК (рибонуклеиновые кислоты).

РНК устроены таким образом, что они встраиваются в цепи ДНК организма-переносчика и меняют их, позволяя проникать в клетки и жить за счет организма. Грубо говоря, бактерии и вирусы оставляют «отпечатки» своими ДНК и РНК, которые и выявляет анализ ПЦР. Эти «отпечатки», как и отпечатки пальцев, являются уникальными для каждого возбудителя. Поэтому ПЦР позволяет выявить заболевание на любых этапах, даже если развитие патогена происходит бессимптомно.

До широкого внедрения ПЦР в гинекологии и урологии на ИППП широко использовались методы:

  • микроскопия — окрашенные и неокрашенные препараты исследуются через микроскоп. Метод очень завязан на опытности лаборанта. Таким методом хорошо выявляются бактерии, имеющие большой размер (гарднереллы, кандиды,трихомонады,гонококки);
  • бактериология — метод заключается в выращивании возбудителей инфекции на питательном агаре, идентификации возбудителя и определения чувствительности его к антибиотикам. Долгое время считался «золотым стандартом». К минусам относят необходимость быстрой доставке материала в КДЛ (клинико-диагностическая лаборатория), сроки выращивания и выяснения чувствительности к группам антибактериальных препаратов (как правило, 5-7 суток);
  • иммуноферментный анализ — Определение антител организма, возникающих в ответ на внедрение антигена возбудителем инфекции. Из плюсов стоит отметить возможность определения стадии заболевания (острая стадия сопровождается наличием IgG в сыворотке крови, хроническая – IgM.) К минусам относится невозможность определения у людей с ослабленным иммунитетом, а также специфичность ИФА. Другими словами, при наличии только результата иммуноферментного анализа, невозможно было выставить диагноз, а можно было только определить, что организм борется с какой-либо инфекцией.

Как происходит сдача анализов на ПЦР

В зависимости от материала, который забирается для проведения анализа ПЦР, существует несколько обязательных правил для пациента. Кровь сдается строго натощак утром. Мочу тоже стоит сдавать утром, первую порцию. Мокрота также сдается натощак, хотя это и необязательно. Мазки сдаются в любое время суток и имеют специфические требования. Мазок из ротоглотки также следует сдавать утром до приема пищи.

Забор материала производится сертифицированным специалистом стерильными одноразовыми инструментами. Берут анализ крови на ПЦР одноразовым стерильным шприцом, из вены забирают приблизительно 1-2 мл венозной крови для выявления таких инфекций как герпес или ВПЧ (вирус папилломы человека). Мочи достаточно 10 мл, мокроты – субстанции, размером со спичечную головку.

Для каждого вида анализа ПЦР существуют свои требования:

  • кровь, как говорилось выше, забирают из вены натощак;
  • мочу следует сдавать утром, первую порцию. Но, если забор является срочным, то достаточно сдать мочу по прошествии 2 часов после последнего мочеиспускания. Это позволит инфекции набрать необходимую критическую массу на 1 мл для более простого обнаружения патогена;
  • как берут соскоб из уретры. Первым делом обрабатывают раствором NaCl 0.9% наружное отверстие уретры. Затем, совершая циркулярные движения, зонд проводят на 2-4 см в уретру. Головку зонда, которая имеет щетинистое строение отсекают и кладут в пробирку со специальным раствором (своеобразный питательный агар для бактерий);
  • из влагалища производят мазок. Предварительно убирают секрет бартолиновых желез, затем из заднего нижнего свода влагалища специальной ватной палочкой происходит забор материала. При видимых патологических изменениях во влагалище мазок следует брать непосредственно на поврежденном участке;
  • как проводят соскоб из цервикального канала у женщин. Удалив слизь из наружных половых путей, зонд на 0,5 – 1,5 см вводят в шейку матки, совершают циркулярное движение и, не касаясь стенок влагалища, удаляют зонд из половых путей. Затем совершают действия, аналогичные соскобу из уретры;
  • из ротоглотки забор происходит натощак. Придерживая кончик языка, зондом производят мазок с задней стенки глотки, по миндалинам или по небным дужкам. Не соприкасаясь со слизистой ротовой полости и зубами, зонд выводится и отправляется на пцр-исследование;
  • из конъюнктивы, предварительно очистив физиологическим раствором гнойные выделения, производят соскоб слизистой нижнего века от латерального к медиальному краю. Веко при этом придерживается медицинским работником во избежание соприкосновения зонда со слизистой глаза и ресницами.

Подготовка к исследованию

Анализ на ПЦР является самым быстрым и достоверным способом на ранних этапах обнаружить инфекцию, но бывают и ложноположительные/ложноотрицательные результаты.

Для сохранения нервной системы как своей, так и сотрудников медицинского учреждения, следует правильно подготовиться к исследованию.

Подготовка к ПЦР у мужчин

Перед исследованием ПЦР мужчинам следует помнить, чего делать нельзя:

  • мочиться за 3 часа до исследования;
  • производить спринцевание и стерильную обработку члена;
  • мыть член мылом, содержащим антибиотик;
  • заниматься сексом за двое суток до ПЦР на ИППП;

Подготовка к ПЦР в гинекологии

Женщинам перед тем как сдать мазок на ПЦР запрещено:

  • при соскобе из уретры запрещено мочиться за 3 часа до исследования;
  • использовать вагинальные растворы с дезинфицирующими свойствами;
  • за двое суток до исследования применять суппозитории для влагалища;
  • использовать антибиотики местно, в том числе и мыло с антибиотиком;
  • занятия сексом за 48 часов до исследования;
  • применять антибиотик внутрь влагалища и уретры;
  • спринцеваться;
  • принимать антибиотики. После последнего приема антибактериального препарата должно пройти не менее 4 недель;
  • сдавать ПЦР во время менструации.

Общие сведения при исследовании мочи для мужчин и женщин

Следует сдать на анализ первую мочу утром, ее среднюю порцию. Другими словами начинать мочиться следует в унитаз. Затем остановить акт мочеиспускания, подставить под уретру баночку для сбора мочи, продолжить мочиться в течении 2-3 секунд, затем снова остановить мочеиспускание и, убрав контейнер, закончить акт мочеиспускания в унитаз.

Женщинам и мужчинам перед тем как сдать ПЦР следует хорошо вымыть наружные половые органы для исключения попадания в мочу смегмы (смесь секрета сальных желез крайней плоти) и выделений из влагалища.

Баночка для мочи должна быть стерильной. Попросите контейнер в клинике, где вы сдаете анализ, либо заранее приготовьте баночку с плотно закрывающейся крышкой и прокипятите их не менее 10 минут.

Непосредственно перед сдачей ПЦР запрещено:

  • мочиться (необходима самая первая порция мочи за день);
  • изменять количество выпитой за сутки до исследования жидкости. Это необходимо, чтобы поддерживать обычный водно-электролитный баланс организма, в котором себя комфортно чувствует потенциальный возбудитель инфекции;
  • использовать уросептики;
  • применять мыло, содержащее в себе антибиотик;
  • заниматься сексом за 12 часов до исследования;
  • при менструации желателен забор мочи уретральным катетером для исключения попадания крови в контейнер с мочой;

Если один из пунктов был нарушен:

Следует воздержаться от проведения диагностики инфекций методом ПЦР. Если же все-таки анализ был сдан, следует его повторить через двое суток. Если при использовании антисептиков и антибиотиков результат оказался «хорошим» – не стоит радоваться. Скорее всего, при наличии определенных жалоб, это ложноположительный результат.

Расшифровка результатов ПЦР

Расшифровка анализов ПЦР очень просто (см примерный бланк выше). Существует положительный и отрицательный результаты исследования. Положительный означает, что инфекция в организме есть, но это не должно наводить страх на пациента. Наоборот, это значит, что теперь можно начать лечение и вовремя остановить патоген. Отрицательный результат, соответственно, показывать отсутствие инфекции в организме.

Также не стоит забывать о ложноположительных/ложноотрицательных результатах. В медицине золотым стандартом является три одинаковых результата подряд в независимых клиниках. Стоит помнить, что в разных клиниках сама КДЛ (клинико-диагностическая лаборатория) может быть одна. То есть, здания и названия будут разные, но все анализы отправляются в одну лабораторию, связывающую эти клиники. Поэтому, получив результат в одной клинике, для того, чтобы удостовериться в правильности данного результата, стоит обратиться еще в две клиники и узнать, не сдают ли они результаты в одну и ту же КДЛ.

Широкий спектр исследований

Метод ПЦР относится к группе обширных анализов. С помощью ПЦР анализа можно определить практически любое заболевание. К сожалению, это не самый дешевый метод исследования, поэтому его не назначают всем пациентам поголовно. Цены могут варьироваться в зависимости от клиники и количества исследований.

Существует полимеразная цепная реакция (анализы ПЦР) на 12 инфекций. Какие инфекции входят в ПЦР 12:

  • микоплазмы гениталиум (mycoplasma genitalium) и гоминис (hominis);
  • трихомонады (trichomonas);
  • хламидии (chlamydia trachomatis);
  • уреаплазмы (ureaplasma, включающая ureaplasma parvum (уреаплазмы парвум));
  • кандиды (candida);
  • гарднереллы (gardnerella vaginalis);
  • гонококк (neisseria gonorrhoeae);
  • антитела IgG, IgM;
  • герпеса двух типов.

Также есть упрощенная ПЦР 6 диагностика. Она исключает уреаплазму парвум, кандиды, гонококк, IgG, IgM, герпес обоих типов.

ПЦР исследование на ВИЧ

ПЦР на ВИЧ следует выделить отдельным пунктом, так как тут существует специфический набор ограничений.

Во-первых, ПЦР на ВИЧ определяет не ДНК вируса иммунодефицита человека, а ДНК измененной вирусом клетки-лимфоцита. В нем будет храниться информация о вирусе и размножаться, создавая все больше пораженных лимфоцитов.

Сдавать анализ следует через 14 суток после известного контакта с ВИЧ-инфицированным человеком. Стоит помнить, что заразность этого вируса несколько преувеличена из-за тяжести нелеченного заболевания. Если произошел контакт через кровь, то тут шанс заразиться самый высокий, однако и он не превышает 85%. При остальных контактах вероятность заражения составляет от 1% до 10%.

При исследовании ПЦР на ВИЧ вероятность ложноположительного результата составляет около 2%, если не было нарушений среди медицинского персонала (правильно маркированная пробирка, не перепутали пробирки местами, не было загрязнения материала при вскрытии пробирки).

Длительность ПЦР может составлять от 4 часов до 7 суток, в зависимости от организованности медицинского учреждения, где происходит диагностика инфекций.

Плюсы и минусы ПЦР

При отражении плюсов ПЦР следует отметить:

  • чувствительность. Как говорилось выше, даже единичный агент, оставленный возбудителем, позволяет обнаружить инфекцию на ее ранней стадии или если она протекает скрытно;
  • широкий спектр. Например, ПЦР 6 позволяет 1 исследованием выявить целых 6 возбудителей;
  • точность. Ложные результаты при данном методе исследования имеют место быть, но их количество сведено к минимуму;
  • скорость. Как правило, пациент уже на следующий день может забрать готовый результат ПЦР исследования.
  • стоимость. ПЦР-исследование не включено в список исследований в системе ОМС. Дорогое высокоточное оборудование требует оплаты своей работы;
  • требования к соблюдению техники исследования и к профессионализму сотрудников;
  • требования к подготовке.

Видеозаписи по теме

Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

При выборе лаборатории стоит обращать внимание на уровень сервиса и ценовую политику.

Некоторые лаборатории предоставляют возможность срочного выполнения части исследований.

Прием некоторых лекарств может повлиять на результаты анализов. Узнайте, как подготовиться к сдаче биоматериала на анализ.

Сдать биоматериал для исследования можно не выходя из дома.

Специальные предложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология. Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология. Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови. Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология. ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.
Читайте также:  Повышенные эритроциты в крови - что это значит?

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода. Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность. При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность. Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов. Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций. ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма. При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции. Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов. Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала. Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча. Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота. Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма. С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости. К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты, т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
  2. Хранение и транспортировка биоматериала. Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
  3. Выделение ДНК из образца. Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
  4. Проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные, включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные, не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
  5. Регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
  6. Интерпретация результатов исследования. Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цены на ПЦР-диагностику

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализаЦена, руб.
Определение ДНК хламидия750
Определение ДНК микоплазмы хоминис540
Определение микоплазмы гениталиум350
Определение ДНК уреаплазмы350
Гонококк, определение ДНК350
Определение ДНК герпеса (разные типы)350–600
Определение ДНК кандиды570
Вирус краснухи, определение РНК800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы)350–1900 [1]

Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 [2] рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 [3] рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» – ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) – уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами – изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Читайте также:  Оборудование «БИОСОФТ» — предрейсовый медосмотр для водителей за 3 минуты!

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

ПЦР диагностика – что это такое? Какие заболевания определяет

  • Рядом с метро Кропоткинская
  • Работаем каждый день с 9:00 до 20:00
  • Стоимость консультации 900 рублей

Вы здесь

ПЦР инфекции

В последние годы медицина и наука совместно прикладывают большое количество усилий для того, чтобы своевременно диагностировать инфекционные заболевания и начинать их лечение еще на ранних стадиях. Во многом помогает в этом метод полимеразной цепной реакции, которая также известна под сокращенным названием ПЦР.

Многие пациенты интересуются, в чем суть исследования, и какие инфекции с его помощью можно диагностировать. Какой биоматериал можно использовать, и как приготовиться к прохождению анализа?

Суть ПЦР-методики

Первоначально ПЦР разрабатывался, как методика научных исследований. Ее активно применяли в молекулярной биологии для исследования различных процессов, происходящих с живыми организмами.

Только спустя приличный промежуток времени реакцию цепной полимеризации стали применять в медицине, как полноценный способ диагностики. Сегодня с ее помощью можно не только выявить острое заболевание. Но и определить хронический процесс, диагностировать генетические патологии. И, что особенно важно, определить наличие инфекции еще до того, как у человека появятся ее первые симптомы. То есть ПЦР остается рабочим методом даже в том случае, если инфекция находится в периоде инкубации.

В основе лежат методы молекулярной биологии, так как анализ пришел именно из этой научной сферы. В биологический материал пациента добавляют специальные реагенты. Они вступают в реакции с ДНК или РНК возбудителя.

То, с чем реагент вступит в реакцию, зависит непосредственно от того, какой материал содержится в исследуемых жидкостях или тканях. После того, как реакция стартовала, начинается копирование выявленных частиц возбудителя. Проходит копирование в несколько этапов, чтобы процесс был более легким. Как только умножение выявленных патологических фрагментов подходит к концу, лаборант, следивший за ходом исследования, может сравнить полученные данные со специальной базой данных. Именно на этом этапе и опознается возбудитель, спровоцировавший патологические изменения в организме человека.

Список выявляемых инфекций

ПЦР инфекции, выявляемые с помощью исследования, очень многообразны. Список включает множество позиций. Причем есть возможность поставить диагноз не только бактериальной, но и вирусной или грибковой инфекции. В результате ценность ПЦР как способа диагностики только возрастает.

С помощью методики диагностируют следующие заболевания:

  • Вирус иммунодефицита человека

ПЦР исследование при подозрении на заражение человека ВИЧ-инфекцией является едва ли не золотым стандартом. С его помощью удается обнаружить в организме этот опасный вирус, который приводит к сильнейшим изменениям в иммунной системе.

Выявить герпес с помощью этого подхода можно не только в стадии обострения, но и во время ремиссии заболевания. Что гораздо важнее, как говорят врачи, появляется также возможность точно определить генотип патогена. А значит и подобрать правильное лечение.

  • Различные инфекции мочеполовых путей

В это группу входят гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз, трихомониаз и др. Список весьма обширен и включает в себя около 30 возбудителей. ПЦР методика постепенно вытесняет более классические методы, такие как микроскопия и посев. Объясняется это тем, что классические способы диагностики требуют большого количества времени. А оно может быть по-настоящему важным в лечении.

ПЦР на гепатиты позволило сделать настоящий прорыв в лечении этих опасных не только для здоровья, но и для жизни заболеваний. Сейчас без полимеразной реакции нельзя представить себе не только правильное определение вида вируса. Но и назначение адекватной терапии пациентам, столкнувшимся с этими вирусными болезнями.

  • Вирус папилломы человека

ВПЧ – еще один распространенный вирус, который диагностируется с помощью цепной полимеризации. Причем часто важно не просто определить наличие вируса, но и установить, что это за штамм. Исследование играет роль для представительниц прекрасного пола. Дело в том, что многие женщины страдают от ВПЧ, некоторые штаммы которого могут способствовать формированию рака шейки матки. Только своевременная диагностика и принятие мер помогут в этом случае избежать беды.

Цитомегаловирусная инфекция, как и ВПЧ, распространена довольно широко. Наибольшую угрозу она представляет для беременных женщин. Так как способствует рождению ребенка с различными дефектами, иногда вплоть до летального исхода. На цитомегаловирус и антитела к нему проверяют многих беременных представительниц прекрасного пола.

Полимеразная цепная реакция в диагностике этой болезни играет не последнюю роль.

Особенно важно это, учитывая тот факт, что туберкулез очень распространен. Он тяжело поддается лечению и часто характеризуется весьма скудной симптоматикой.

ПЦР чаще всего используют для того, чтобы подтвердить итоговый диагноз, который уже был заподозрен из-за положительной пробы манту. Естественно, список инфекционных болезней, выявляемых с помощью полимеразной реакции, далеко не полный. Доктор может назначать обследование и при подозрении на другие ЗППП или инфекционное поражение иных органов и тканей.

Какой биоматериал может использоваться

Как отмечают доктора, для подтверждения диагноза могут применяться самые разные биологические материалы.

Наиболее часто применяют:

  • Сыворотку или плазму крови, или саму кровь. В них выявляются ВИЧ, цитомегаловирус, все гепатиты, передаваемые половым путем, герпес. Также кровь берется в том случае, если необходимо определить генетические заболевания.
  • Соскобы с различных слизистых оболочек. Их особенно часто рекомендуют выполнять, например, при подозрении на заболевания, передающиеся половым путем. Эффективны соскобы со слизистых, если патогенные микроорганизмы поражают именно слизистые оболочки в первую очередь.

  • Различные биологические жидкости. Пациенту мужского пола может потребоваться сдать на анализ секрет простаты или сперму. Если речь о женщине, то у нее для исследования могут браться околоплодные воды во время беременности. У пациента любого пола берутся слюна, смыв с бронхов, суставная смазка и жидкость, находящаяся в спинном мозге.
  • Мокрота. Ее забирают для оценки в том случае, если подозревается легочная форма некоторых бактериальных заболеваний. Также ее обязательно исследуют при подозрении на туберкулезное поражение.
  • Моча. Ее исследование рекомендуется при многих урогенитальных исследованиях. У представителей сильного пола оценка мочи нередко может выступать вместо взятия соскоба с поверхности уретры, так как эта процедура травматична и весьма неприятна.
  • Биоптаты. Используются довольно редко. Их рекомендуют брать из желудка или двенадцатиперстной кишки в том случае, если у пациента есть подозрение на заражение хеликобактером.

Особенности подготовки к исследованию

Чтобы ПЦР анализ на инфекции оказался эффективным и достоверным, к его сдаче необходимо правильно подготовиться. Также рекомендуется соблюдать ряд правил при сдаче биоматериала, чтобы избежать столкновения с недостоверными результатами. Кровь всегда сдается по стандартной схеме.

Пациенту доктор советует прийти в больницу в утреннее время, на голодный желудок. Полученную кровь, плазму или сыворотку стараются в ближайшее время отправить в лабораторию.

Накануне исследования рекомендуется отказаться от слишком острых, соленых или жареных блюд, не пить алкоголь. Также пациентам рекомендуется избегать воздействия на организм стрессовых факторов. Чтобы сдать мочу, подготовка в принципе аналогична.

Дополнительно пациенту рекомендуется приобрести в аптеке специальный стерильный контейнер и наполнить его в соответствии с инструкцией, полученной от доктора. Использовать банки и другие нестерильные емкости для сдачи анализа нельзя!

Если емкость заполняется в домашних условиях, доставить ее больницу нужно максимум в течение двух часов. При этом нельзя допускать остывания емкости.

Соскоб со слизистых сдается всегда в условиях больницы. При этом как мужчинам, так и женщинам рекомендуется минимум на сутки отказаться от секса и не мочиться за 2-3 часа до сдачи анализа.

Важно помнить, что врач всегда даст подробную инструкцию относительно того, как правильно собирать материал для исследования. Если получить инструкцию от доктора не удалось, его всегда можно спросить, каких рекомендаций стоит придерживаться, чтобы результаты были достоверными.

Особенности расшифровки

Расшифровка результатов может показаться совсем простым делом. Ведь существует только два варианта ответа: положительный и отрицательный. Если результат отрицательный, значит человек, сдававший биологический материал, не заражен той инфекцией, проверку на которую он проходил. Если же результат положительный, значит инфекция присутствует в организме. И нужно как можно скорее начать терапию, чтобы с ней справиться.

Как отмечают доктора, расшифровка только кажется легким делом.

На самом же деле ее выполнение – дело непростое. Потому что необходимо учитывать хоть маленький, но риск ложноположительных и ложноотрицательных реакций. Только доктор, оценив симптомы болезни у конкретного пациента, его общее состояние и другие параметры, может сказать, насколько можно доверять полученным результатам. Если они оцениваются, как сомнительные, больного с большой долей вероятности отправят сдавать анализы повторно.

Точность методики

Многих пациентов интересует вопрос о том, насколько сильно можно доверять исследованию. Как отмечают врачи, это один из самых высокоточных методов диагностики различных инфекций, которые существуют на сегодняшний день. Его точность объясняется тем, что работа происходит с ДНК и РНК. А эти элементы строго индивидуальны для каждого вида патогенных микроорганизмов. Следовательно, риск ошибки сведен к минимуму.

Опираясь на полимеразную реакцию цепного типа, можно узнать:

  • есть в организме патогенные элементы, или они отсутствуют;
  • определить, что конкретно за инфекция стала причиной появления тех или иных симптомов;
  • поставить диагноз даже в том случае, если микробов или вирусов еще очень мало, и другими методами диагностики они не улавливаются.

Важно помнить, что даже ПЦР не дает 100% надежности. Существует риск столкновения с неверными результатами. И только врачебная оценка может помочь точно понять, стоит ли человеку начинать лечение.

Преимущества и недостатки

Как и любой другой метод, ПЦР обладает своими преимуществами и недостатками. Преимуществ, как отмечают доктора, на сегодняшний день больше.

Среди них:

  • высокая чувствительность тестовых систем, позволяющая ставить диагнозы даже в сложных случаях, когда возбудитель еще находится в периоде инкубации;
  • высокая специфичность тестов, позволяющая точно понять, что за патоген стал причиной негативных процессов;

  • универсальность методики, заключающаяся в том, что с помощью одного метода можно без проблем провести исследование на разные микроорганизмы, используя один и тот же биоматериал;
  • быстрота исполнения, позволяющая получить результаты максимум через сутки после проведения анализа, а иногда и значительно быстрее;
  • возможность обследоваться на заражение сразу несколькими инфекционными заболеваниями без необходимости сдавать множество разных биологических материалов.

Несмотря на большое количество преимуществ, недостатки у ПЦР-метода также имеются. Во-первых, требуется хорошее техническое оснащение лаборатории. Во-вторых, лаборант должен быть хорошо обучен и обладать специфическими знаниями, чтобы не допустить ошибок в технологии. Если два этих условия соблюдаются, реакция цепной полимеризации становится эффективным способом постановки диагнозов!

Что такое ПЦР: какие заболевания можно выявить с помощью этой диагностики

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) –​ один из самых молодых и вместе с тем точных методов лабораторной диагностики, который произвел революцию в современной молекулярной биологии.

Метод ПЦР позволяет всего за несколько часов перевести микрограммы генетического матери­ала в приемлемые для последующих исследова­ний количества вещества. Вот почему благода­ря открытию полимеразной цепной реакции был расшифрован геном человека, и даже родилась новая индустрия – биотехнология. Сегодня этот относительно простой и недорогой способ ис­пользуется ежедневно в областях, весьма дале­ких от академической науки: для диагностики за­болеваний и контроля эффективности лечения, идентификации бактерий и вирусов, установле­ния отцовства, изучения тысячелетних мумий и даже для поиска преступников. Учитывая широ­ту применения, относительную простоту выпол­нения и стопроцентную точность результатов, ПЦР можно отнести к числу фундаментальных научных технологий ХХ века.

Секрет «приумножения»

В основе этого гениального метода лежит тот факт, что каждый живой организм имеет толь­ко свою уникальную последовательность генов ДНК (или РНК, когда речь идет о некоторых вирусах). Именно это свойство является идеаль­ным маркером присутствия чужеродного ми­кроорганизма в любом организме. Если в пробе присутствуют даже следовые количества такого «стороннего» ДНК – значит, организм каким-то образом уже сталкивался с данной инфекци­ей. Однако как же обнаружить или проанализи­ровать структуру определенного отрезка ДНК, имея в распоряжении всего лишь крошечный образец, ведь, как правило, люди не оставляют после себя контейнер крови или других ДНК-содержащих материалов? В большинстве случаев для лабораторной диагностики или криминали­стической экспертизы специалисты имеют в сво­ем распоряжении минимальное количество ма­териала: единичные капли крови, спермы, слюны или частички волос. Для проведения полноцен­ного анализа и получения достоверного резуль­тата этого недостаточно.

Американский биохимик Кэри Муллис неожи­данно придумал способ, посредством которого можно увеличить крошечный образец ДНК во много миллионов раз, сделав количество мате­риала пригодным для анализа и получения абсо­лютно точных результатов. Его гениальная идея «приумножения» через десять лет принесла уче­ному Нобелевскую премию по химии.

Филигранная работа

Как известно, молекула ДНК состоит из двух ни­тей, которые обвивают друг друга в виде спира­ли. В них и содержится уникальное генетическое описание любого организма. Суть метода ПЦР (и гениальность открытия Муллиса) состоит в том, что он разъединил эти нити, а затем догадался закрепить на каждом конце по метке. Потом, вос­пользовавшись другой молекулой, которая называется ДНК-полимераза, сумел сделать копию отрезка ДНК между метками. Таким образом ко­личество генетического материала удвоилось. Проделывая такую манипуляцию снова и снова, можно получить огромное количество одинако­вых цепочек ДНК. Ведь в результате каждого такого цикла ПЦР фрагмент искомой ДНК удваива­ется, а сам цикл повторяется столько раз, сколько это необходимо. Современные приборы, исполь­зуемые для проведения ПЦР (амплификаторы), способны увеличить фрагменты ДНК от несколь­ких сотен до тысяч пар оснований в течение не­скольких часов. Фактически метод ПЦР позво­ляет ДНК копировать саму себя и увеличивать количество исследуемого материала до размеров, которые легко опознать. Применение данной ме­тодики позволило идентифицировать по выде­ленному фрагменту ДНК любой интересующий объект: вот ДНК возбудителя гриппа, это – стафи­лококка, а это – вируса герпеса.

Читайте также:  Электромиография и исследования скорости проведения импульса по нерву

Стоит отметить, что ранее для клонирования участка ДНК классическими генно-инженерны­ми методами требовались в среднем 0,5-2 го­да и огромное количество весьма трудоемких генноинженерных действий высококвалифицированного персонала. Теперь задача упро­стилась: для получения результата необходимо всего несколько часов. А для получения на 100% точного результата можно использовать мини­мальное количество материала: отдельный че­ловеческий волос, соскоб ткани, капельку мочи, мокроты или околоплодных вод. Благодаря тому, что ДНК сравнительно хорошо сохраняется, да­же мозг мумии или тело мамонта, пролежавшего 40 тысяч лет в вечной мерзлоте, сможет со сто­процентной точностью рассказать, чем болели доисторические жители. Вот почему метод по­лимеразной цепной реакции ДНК совершил на­стоящую революцию в современной молекуляр­ной биологии.

!

Метод ПЦР позволяет всего за несколько часов перевести микрограммы генетического материала в приемлемые для последующих исследований количества вещества.

Безграничные возможности

Сейчас диагностические исследования с помо­щью ПЦР стали рутинной работой практически каждой молекулярно-биологической лаборато­рии. Преимущества данного метода очень скоро оценили врачи, ведь с его помощью можно обна­ружить любой патогенный микроорганизм, если в пробе найдется хоть одна микрочастица бакте­рии или вируса. Причем обнаружить возбудитель любого заболевания можно задолго до того, как он размножится и вызовет болезнь. Поэтому се­годня эту методику используют не только для то­го, чтобы поставить диагноз, но и для контро­ля эффективности лечения. Применяют ПЦР и для определения мутаций в ДНК, если есть риск развития генетических забо­леваний, или для определе­ния возможных рисков их развития. А еще, исполь­зуя уникальную последовательность ДНК при ми­нимальном количестве исходного ДНК-содержащего материала, можно установить не только отцовство, но и степень родства.

Специфичность ПЦР-анализа позволяет об­наружить даже единичные клетки патогенных микроорганизмов в тех случаях, когда другие ме­тоды бессильны, например, при большей части хронических персистирующих инфекций, воз­будители которых могут находиться в организме длительное время (все типы герпеса, токсоплаз­моз, болезнь Лайма, хронические вирусные гепатиты). Разобраться, когда начинается рецидив, вялотекущий процесс или выздоровление, мож­но только с помощью ПЦР-диагностики.

В криминалистике этот метод получил на­звание в стиле своей профессии – геномная дактилоскопия. Эксперты сыскного дела ис­пользуют его для идентификации личности по ДНК-содержащим жидкостям и тканям.

С помощью полимеразной цепной реак­ции можно проводить исследования даже мумифицированных древних останков. Уже были проделаны научные исследования ДНК неандертальцев, египетских мумий, насекомых, за­консервированных в янтаре миллионы лет назад, а также бактерий глубокозалегающего древнего арктического льда. Все это позволило ученым заглянуть в историю эволюции.

ПЦР-диагностику активно используют для мо­ниторинга состояния окружающей среды, контроля качества питьевой воды, продуктов питания, а также в фармакологии, ветеринарии.

В наше время крупные научные открытия совершают не гении-одиночки, как это было в старые добрые времена, а большие коллективы, которые могут состоять из нескольких междисциплинарных научных групп. Однако даже из этого правила есть исключения. Блестящая история открытия метода ПЦР-диагностики – пример эпохального изобретения, сделанного гениальным одиночкой.

Кэри Муллис (Кагу Ми1П$) родился 28 декабря 1944 года в США в семье фермера. В детстве Муллис масте­рил и запускал самодельные ракеты, эксперименти­ровал с химическими веществами. Далее была учеба в Технологическом институте штата Джорджия, где в 1966 году будущий ученый получил степень бака­лавра. Спустя шесть лет Кэри Муллис получил степень доктора по биохимии в Калифорнийском университете в Беркли.

В молодости кроме химии Муллис всерьез интересо­вался математикой и физикой.

В 1979 году поступил на работу в компанию «Сетус» в Эмервилле (Калифорния) в качестве специалиста в области ДНК. Занимался синтезом олигонуклеотидов и в результате изобрел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Некоторое время ученые не воспри­нимали идею Муллиса. Однако после публикации в журналах Science (1985) и Nature (1986) метод ПЦР стал быстро распространяться в практике.

В 1993 году Муллис получил Нобелевскую премию «за вклад в развитие методов химии на основе ДНК – за изобретение метода полимеразной цепной реакции».

Большой минус

Сверхчувствительность ПЦР-диагностики мо­жет обернуться и другой стороной медали. Ес­ли на лабораторном инвентаре – пипетках, пробирках и прочем оборудовании – будет присутствовать даже микроскопическое коли­чество «чужеродной» ДНК, результат анализа может оказаться неправильным. Именно по­этому для ПЦР-диагностики очень важно об­ращаться только в сертифицированные лабо­ратории, где строго соблюдают необходимый технологический режим.

Что дальше?

Метод ПЦР-диагностики уже давно вышел за пределы традиционной лабораторной диагно­стики. Одно из самых перспективных направ­лений его использования – персонализирован­ная медицина. Например, на введение одного и того же препарата три пациента с одинако­вым диагнозом могут отреагировать абсолют­но по-разному: один выздоровеет, второй не отреагирует, у третьего появятся нежелатель­ные токсические эффекты. Спрогнозировать, как человек перенесет тот или иной препарат, можно с помощью ПЦР-диагностики. Такая методика прогнозирования получила назва­ние предварительное генотипирование (англ. prospective genotyping). В мире уже насчитыва­ются десятки лекарств, которые никогда не на­значаются без предварительного генетическо­го анализа.

!

Учитывая широту применения, относительную простоту выполнения и стопроцентную точность результатов, ПЦР можно отнести к числу фундаментальных научных технологий ХХ века.

Анализ крови на ПЦР

8 минут Автор: Любовь Добрецова 1315

ПЦР или полимеразная цепная реакция (Рolymerase Сhain Reaction) – это высокоинформативный метод диагностики, предназначенный для выявления генетических отклонений и дифференциации инфекционных заболеваний.

Клинико-лабораторная оценка биоматериала (крови, мочи и т.п.) основана на определении генно-молекулярной структуры возбудителя инфекции, что нивелирует риск ложноположительного результата анализа. За научно-медицинскую ценность метода его разработчик Кэри Мюллис был удостоен Нобелевской премии в 1993 г.

Специфика метода ПЦР крови на инфекции

Анализ крови на ПЦР (PCR) обнаруживает активных инфекционных агентов и неактивных патогенов, погибших под воздействием медицинских препаратов, на любом этапе развития болезни. Такая способность обусловлена выявлением не просто возбудителя инфекции, а его генома:

  • ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) бактерий, паразитов, грибков;
  • РНК (рибонуклеиновой кислоты) вирусов.

Пробирку с образцом крови, взятой у пациента, размещают в амплификаторе – реакторе, обеспечивающем последовательное нагревание и охлаждение образца. К биоматериалу добавляют реакционную смесь. В амплификаторе производится более 30 циклов смены температурного режима, каждый из которых включает 3 этапа (денатурацию, отжиг праймеров, элонгацию).

В ходе многократной реакции амплификации:

  • разрываются водородные цепи макромолекул (ДНК и РНК);
  • образуются комплементарные комплексы матрицы с короткими фрагментами РНК и ДНК (праймеры);
  • термостойка ДНК-полимераза достраивает матричную цепь, и формирует множественные генетические копии возбудителя.

При достаточном количестве копий амплификатор дает качественно-количественную оценку обнаруженному возбудителю. Таким образом, молекулярная диагностика решает три задачи одновременно:

  • обнаруживает инфекционного агента;
  • дифференцирует его принадлежность (вирус, бактерия и т. д) и разновидность;
  • определяет дальнейшую тактику лечения и выбор медикаментов (в соответствии с установленным заболеванием).

ПЦР крови применяют для определения вирусов и бактерий либо тяжелых паразитарных внекишечных инвазий. Генная информация является уникальной, поэтому точность исследования ПЦР практически 100%. Рolymerase Сhain Reaction определяет инфекцию даже при отсутствии активности возбудителя и выраженных симптомов болезни.

Области применения анализа

В настоящее время в медицине и криминалистике, а также для клонирования генов и установления родственных связей применяют более десятка разновидностей амплификации. В ежедневной практике кровь на ПЦР назначают медицинские специалисты:

  • педиатр;
  • гинеколог;
  • уролог;
  • дерматовенеролог;
  • инфекционист;
  • фтизиатр;
  • пульмонолог.

Генно-молекулярная диагностика успешно применяется в неонатологии. С помощью полимеразной цепной реакции выявляют возможное заражение младенцев внутриутробно и сразу после появления на свет. Для детей с риском инфицирования анализ проводят в первые 48 часов после рождения и повторно в возрасте 3-6 месяцев.

Кроме инфекционных заболеваний, Рolymerase Сhain Reaction помогает диагностировать наследственные аномалии и мутации. В перинатальный период методом ПЦР у будущего малыша можно обнаружить:

  • гемофилию – нарушение свертываемости крови;
  • болезнь Хантера – патологии обменных процессов;
  • мусковидоз – нарушение внешнесекреторной функции желез;
  • нервно-мышечную миодистрофию Дюшенна-Беккера;
  • первичный иммунодефицит;
  • синдром Альпорта – патологию почек.

PCR используют для определения мутантных генов и их РНК-продуктов в диагностике онкологических заболеваний. Высокая чувствительность молекулярного метода обеспечивает выявление онкопатологий в доклинической стадии, когда очаг опухоли не превышает 0,01 см 3 в размерах.

По обнаруженным онкогенам, биологическим канцерогенам и антионкогенам диагностируют исходную стадию:

  • онкогематологических болезней (рака крови и лимфатической системы);
  • злокачественных образований молочных желез;
  • аденокарциномы толстой кишки;
  • меланомы;
  • рака ротоглотки;
  • наследственных форм рака.

Высокой онкогенностью обладают штаммы 16, 18, 31, 33, 35 ВПЧ (вируса папилломы человека). В 50% случаев вызывают карциному шейки матки у женщин – раковую опухоль эпителиальных клеток. Обнаружение неопластических клеток в доклинической стадии рака значительно повышает шансы на успешное лечение болезни.

Особую ценность ПЦР имеет для Службы крови. Метод позволяет определить заражение гепатитами, ВИЧ, сифилисом в бессимптомный инкубационный период. На этой стадии иммунная система еще не продуцирует антитела к возбудителям, и выявить заболевания с помощью серологических исследований невозможно.

Спектр возможностей ПЦР в диагностике инфекций

Анализ полимеразной цепной реакции крови используется для выявления ЗППП (заболеваний, передающихся половым путем) и урогенитальных инфекций, инфекционных болезней легких, печени, пищеварительной системы, так называемых, детских болезней.

Вирусы
герпесовирус1 типобычный герпес
2 типгенитальный герпес
3 типкраснуха
4 тип (цитомегаловирус)цитомегалия
5 тип (Эпштейн-Барр)инфекционный мононуклеоз
папилломы человека (21 штамм)папилломатоз
HAV, HBV, HCVгепатит А, В, С
иммунодефицитаВИЧ, СПИД
Бактерии
бледная трепонемасифилис
гарднереллыгарднереллез
гонококкигонорея
уреаплазмауреаплазмоз
сальмонелласальмонеллез
палочка Кохатуберкулез
листериялистериоз
стрептококки и стафилококкисепсис, пневмония, менингит
Паразиты, прокариоты, простейшие
описторхи (печеночные сосальщики)описторхоз
плазмодиймалярия
токсоплазматоксоплазмоз
лямблиилямблиоз
хламидиихламидиоз
трихомонадатрихомониаз
микоплазмамикоплазмоз
эхинококкиэхинококкоз
шистосомышистосомоз
цестодыальвеококкоз

Комплексный анализ на ЗППП носит название «профиль ПЦР-12», по количеству определяемых возбудителей. В профиль входят половые инфекции:

  • хламидиоз;
  • гонорея;
  • трихомониаз;
  • сифилис;
  • ВИЧ;
  • обычный и генитальный герпес;
  • цитомегалия и инфекционный мононуклеоз;
  • папилломатоз;
  • гепатиты В, С.

А также микоплазмоз и уреаплазмоз – не относящиеся к венерическим болезням, но передающиеся при интимной близости. Отдельный анализ крови ПЦР на кандидоз (молочницу) практикуется редко, поскольку заболевание легко выявляется по мазку из влагалища (у мужчин из уретры).

Показания к проведению ПЦР-12

Прямыми показаниями являются симптоматические проявления, характерные для половых инфекций:

  • длительная фебрильная (38-39 ℃) температура тела;
  • увеличение лимфатических узлов;
  • кожная сыпь;
  • зудящие высыпания в области наружных половых органов;
  • поллакиурия (учащенное мочеиспускание), сопровождающаяся жжением в уретре;
  • боли в нижней части живота, иррадиирующие в поясницу;
  • диспареуния (болезненные ощущения во время интимной близости и после секса);
  • лейкоррея у женщин (неспецифические влагалищные выделения с неприятным запахом) и выделение слизи из уретры у мужчин.

ПЦР-12 рекомендовано пройти при планировании беременности.

Основные достоинства PCR

Метод полимеразной цепной реакции применяется в совокупности с другими исследованиями или заменяет:

  • Микроскопию (обычную и люминесцентную) – изучение крови под микроскопом (люминесцентным микроскопом).
  • Бактериологический посев – высаживание биоматериала на питательные для паразитов, бактерий и т. д. среды, и выращивание в лабораторных условиях колоний болезнетворных микроорганизмов.
  • Серологические тесты – основаны на выявлении специфических антител (иммуноглобулинов) к антигену (инфекционному агенту): реакция иммунофлуоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

ПЦР используют для уточнения спорных диагнозов, при получении ложноположительных и ложноотрицательных результатов других анализов. Прерогативы ПЦР-диагностики:

  • Высокая точность типизации возбудителей. Оценка уникальных для каждого микроорганизма фрагментов ДНК и РНК дает возможность распознать конкретный штамм вируса, разновидность паразитов, грибков и бактерий.
  • Гиперчувствительность к инфекционным агентам. Чтобы обнаружить инфекцию, для ПЦР достаточно молекулярного присутствия патогенного микроорганизма.
  • Оперативность проведения анализа. В отличие, к примеру, от бакпосева для выполнения которого требуется 7-14 дней, результаты PCR можно получить через 24 часа (в платных диагностических центрах интервал ожидания может быть сокращен до 5-7 часов).
  • Универсальность. Диагностические возможности метода в области инфекционных болезней практически не ограничены.
  • Комплексность. Одного образца крови достаточно для проведения исследования на несколько патогенных микроорганизмов.
  • Специфичность. При проведении ПЦР исключены перекрестные реакции иммуноглобулинов с близкородственными не комплементарными антигенами, следовательно, невозможен ложноположительный результат исследования.

О недостатках Рolymerase Сhain Reaction можно говорить в свете высоких требований к оснащению лаборатории и квалификации медицинского персонала. Анализ проводится в условиях абсолютной стерильности, со строгим соблюдением температурного режима. Присутствие посторонних ДНК в воздухе может исказить результаты исследования.

Подготовка к анализу крови методом полимеразной цепной реакции

Подготовительные мероприятия обеспечивают максимальную объективность результатов исследования. Правила подготовки к ПЦР анализу крови включают:

  • отказ от приема медикаментов за 5-7 дней до сдачи крови;
  • ограничение жирной пищи и исключение из рациона спиртных напитков за 2 дня;
  • сокращение физической активности накануне забора крови;
  • соблюдение режима голодания 8-12 часов (сдавать кровь необходимо натощак).

За час до процедуры рекомендуется отказаться от никотина (не курить). Забор крови производится из вены, в утренние часы. В современных лабораториях, имеющих условия для проведения ПЦР-диагностики, биоматериал берут при помощи стерильных вакутейнеров. Кровь пациента хранится в течение двух недель, что делает возможным проведение дополнительных тестов.

О результатах и ценах

Результаты исследования можно получить на следующий день. Количественный показатель, иначе, число полученных копий инфекционного агента, указывается редко. В большинстве случаев пациент получает бланк с качественной интерпретацией результата. Варианты могут быть:

  • «обнаружено» или «положительно» – наличие инфекционного заболевания;
  • «не обнаружено» или «отрицательно» – отсутствие заражения.

Положительный результат при отсутствии выраженных проявлений болезни свидетельствует о латентном бессимптомном течении инфекции или пребывании возбудителя в стадии инкубации. Исследование относится к средней ценовой категории.

В клиниках Москвы и других крупных городов стоимость определения одного вида инфекции варьируется от 300 до 500 руб. Комплексный анализ ПЦР-12, как правило, обходится дешевле, чем проверка на каждый возбудитель отдельно.

Итоги

Полимеразная цепная реакция (реакция амплификации) – современное клинико-диагностическое исследование крови и других биожидкостей человека. Анализ основан на обнаружении и дифференциации молекулярного фрагмента вируса, бактерии и т. д. для определения инфекции или поврежденного гена для выявления мутаций, анормальных отклонений в развитии, наследственных патологий.

Ключевые преимущества ПЦР перед иными лабораторными тестами:

  • диагностика заболеваний в исходном периоде (при отсутствии психосоматических проявлений);
  • обнаружение нескольких патогенов, атакующих организм по одному биообразцу;
  • чувствительность практически ко всем инфекционным агентам;
  • определение начальных (доклинических) форм рака;
  • определение генетических патологий во внутриутробном периоде развития ребенка.

Исследование является высокоинформативным, доступным и оперативным по времени выполнения. Результаты можно получить на следующий день после анализа.

Добавить комментарий